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石蜡包埋切片DNA样本、血液游离DNA样本、法医DNA样本和考古DNA样本都是非常重要的实验材料，但是这些材料的DNA不但含量稀少，而且往往都高度降解，使用前都需要先进行扩增。目前进行扩增的方法很多，包括PEP-PCR、DOP-PCR、MDA、SCOMP、balanced-PCR等，但各有缺点，不尽人意。为此，我公司开发了本试剂盒。

• 即开即用，十分简单方便，用户不需要辛苦摸索条件。
  
• 直接使用纯化的线状dsDNA为模板。本制品不包括纯化试剂盒。如果DNA是古旧的有损伤的DNA，需要使用损伤DNA修复及扩增试剂盒(货号：KL221136)。
  
• 最低可以使用5pg的模板DNA（一个人体细胞的DNA为6pg），最后可以扩增上1千-1万倍（起始模板DNA越少，扩增倍数越高）。
  
• 优化的反应体系，所有反应一管式完成，避免了珍贵痕量样本的丢失。
  
• 使用高保真的phi29 DNA聚合酶进行扩增，避免了在扩增过程中引入新突变。
  
• 扩增试剂含荧光染料，可以实时监测扩增反应过程，不需要跑电泳检测，节约宝贵的扩增后样品。
  
• 本制品足够50次20μL体系的环化-扩增反应。
  
• 得到的DNA可以直接用于二代测序、酶切或qPCR等后续实验。

1. 首次使用本试剂盒时，需要在RCA专用随机引物溶解液化冻后，将110μL全部加入到RCA专用随机引物干粉管中，涡旋震荡半分钟溶解，短暂离心，得RCA专用随机引物。放冰上待用。没用完的需要放-20℃长期保存。
   
2. DNA环化-扩增反应：
   
   • 按下表向各PCR管中加入各成分：
     

     成分	管1（样本）	管2（无模板对照）
     自备模板DNA(5pg～100ng)	1～8.5μL	不加
     10×DNA环化-扩增缓冲液	1μL	1μL
     超纯水	至9.5μL	至9.5μL
     DNA环化酶A	0.5μL	0.5μL
     合计	10μL	10μL

   • 在PCR仪器上37℃ 2小时，65℃ 20分钟灭活酶。
     
   • 按下表继续向各反应管中加入各成分：
     

     成分	管1	管2
     超纯水	4.0μL	4.0μL
     10×DNA环化-扩增缓冲液	0.5μL	0.5μL
     DNA环化酶B	0.5μL	0.5μL
     合计	15μL	15μL

   • 室温放置2小时，65℃ 10分钟灭活酶。
     
   • 按下表继续向各反应管中加入各成分：
     

     成分	管1	管2
     超纯水	1.5μL	1.5μL
     10×DNA环化-扩增缓冲液	0.5μL	0.5μL
     RCA专用随机引物溶液	2μL	2μL
     合计	19μL	19μL

   • 放在PCR仪器上，设置95℃加热5小时，自然冷却到室温。
     
   • 向各反应管中加入1μL phi29 DNA聚合酶(10U/μL)。
     
   • 混匀后放荧光定量PCR仪器上，设置30℃保温16小时，每10分钟设置成一个循环，每个循环采集一次SYBR通道的荧光信号。

3. 由于是可以实时检测RCA扩增反应，所以RCA扩增反应不一定进行16小时，可以在扩增荧光信号的曲线进入平台期（已经没有新的DNA合成）后结束。因为phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，在扩增反应耗尽dNTP后，它可能会进入酶切模式，逐渐降解已经合成的DNA。
   
4. 65℃保温10分钟灭活酶。由于phi29 DNA聚合酶有很强的3-5外切酶活性，因此必须灭活，否则它将逐渐降解反应管中已经合成的DNA。
   
5. 典型实验结果。有扩增的样本将有平缓的S荧光曲线，无模板对照将没有此扩增曲线。
   
6. 如果没有荧光定量PCR仪器，则只能电泳检测或PCR检测是否有扩增。
   
7. 扩增所得DNA可以用于后续实验，如qPCR扩增。如果后续实验需要纯化去除dNTP（如通过测OD确定浓度）或去除RCA专用随机引物，则需要自备试剂盒进行纯化处理。